转基因油菜研究进展

油菜是重要的油料作物，对油菜的改良是育种家们长期努力的目标。据报道，1998年全球转基因油菜种植面积为240x104hm2占全球油菜种植面积的9％，1999年增至280x104hm2，占全球油菜总面积的11％，2000年全球转基因作物面积为4420x104hm2，占全球作物种植面积的16％(官春云，2002)。多年来，许多育种工作者试图采用传统的育种手段来获得油菜良种，但进展十分缓慢。随着基因工程技术的发展，人们愈来愈倾向于通过基因工程的手段改良油菜的产量、品质及抗逆性。因此，建立良好的油菜转化体系至关重要。　　1油菜转基因的受体系统及筛选标记　　1.1受体系统植物转基因受体系统是指选择合适的器官、组织或细胞进行转基因后，能通过组织培养或其它途径再生出新生植株的无性繁殖体系。因此，适宜的油菜转基因受体系统的建立，是创造转基因油菜的关键环节。　　1.1.1子叶、下胚轴受体系统　　Moloney等(1989)年发现芸薹属植物种子萌发以后，切取带有1-2mm子叶柄末端切口处的细胞不但再生能力强，而且易被农杆菌感染和转化。近年来，国内外许多学者分别以油菜的子叶、下胚轴、茎段为受体进行基因转化。Pua等(1987)建立了茎段再生体系，并以此为受体，转化率为10％。Moloney等(1989)以叶柄为受体的转化率为55％。以子叶、下胚轴、茎段为受体，具有简便、快速、转化率高f1.5％～55％)等优点。但再生植株易为嵌合体，基因型也可能是杂合的(段英姿等，2003)。　　1.1.2原生质体受体系统　　自1972年第一株烟草体细胞杂种植株问世以来，原生质体融合技术在不断完善和发展。油菜的原生质体培养起步于20世纪70年代，到目前为止，在栽培油菜的3个种中都利用原生质体培养获得了再生植株(Chieneta1，1982；Glimeliuak，1984；Puite，19921。以原生质体为受体能得到高度纯合体，但其再生及分化困难，转化频率较低，且操作复杂(段英姿等，2003)。　　1.1.3小孢子受体系统　　油菜小孢子培养和再生技术，在国内外已经发展的比较成熟。小孢子本身具有单细胞性和单倍体双重特点。因此用它作为转化受体进行外源基因导入，不仅有利于基因表达还可以加速转基因材料的纯合，而且可缩短育种年限。陈军等(1998)以“中双1号”、“中双3号”、“中油821”、“89008”等油菜品种，建立了甘蓝型油菜游离小孢子再生胚状体的实验体系，掌握了受体最佳发育时期，使再生频率高达每花蕾21.2个胚状体，并以此为受体得到转基因植株。　　1.2筛选标记　　在植物转基因工程中，如何选择和筛选转化体是一个重要的问题，在油菜转基凶工程中应用到许多选择标记基因和报告基因，使人们能快速、准确地从大量非转化体中获得转基因植物。油菜较常用的筛选标记基因有新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，潮霉素磷酸转移酶基因(程振东等，1994)和二氢叶酸还原酶基因(Puaeta1，1987)及bar基因、Bt基因(卫志明等，1998)，它们分别介导对卡那霉素、潮霉素、氨基喋呤、除草剂、巴龙霉素的抗性。至于哪一种效果最好一定程度上取决于基因型和可利用的转化载体，研究表明对不同基因型的筛选效果亦不同。筛选剂最常用的是卡那霉素，应用卡那霉素筛选不乏成功的报道，但有的学者认为(Puaeta1，1987)，卡那霉素对于甘蓝型油菜来说，有时效果很差，这可能与基因型有关。潮霉素、庆大霉素、新霉素应用成功报道亦不少。Schr~der等(1994)研究了在甘蓝型油菜转化过程中4种选择标记基因(nptⅡ，aadA，bar,Spt)在筛选过程中的效果，认为用aadA基因(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)作为标记对转化体进行筛选最合适。　　2油菜转基因方法　　在植物基因工程研究中，关键步骤之一是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内，使之发生定向的、永久性的遗传变异，即所谓的植物遗传转化。为了方便有效地将外源基因导入植物体内，人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前应用到油菜转基因中的遗传转化方法主要有农杆菌介导转化法和外源基因直接导入法。　　2.1农杆菌介导转化法　　农杆菌在侵染植物伤口时，可将其携带质粒上的一段DNA(T-DNA)整合到植物基因组上，并在植物体内表达。因此，农杆菌作为一种天然载体系统被广泛应用到植物基因转化中(表1)，成为植物基因转化的首选方法。农杆菌介导的转基因方法具有以下优点：不需要专门仪器；宿主范围广，包括大多数双子叶植物和少数单子叶植物；插入外源基因的片段较大，可达50Kb以上；转化率明显高于其它直接转化方法；外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少，多为单拷贝；整合的外源基因变异小，后代的分离规律也遵循孟德尔遗传规律。缺点是仍受宿主范围和菌株特异性等因素的限制(Santar6meta1，1998；TrickandFiner，1998)。　　2.2外源基因直接导入法　　在油菜的遗传转化中，有越来越多的研究倾向于采用外源基因直接转化法，因其不受宿主范围的限制，也不需使用特定的载体。在早期的油菜遗传转化研究中取得成功的方法有3种：电激法、PEG法和显微注射法。近年来发展起来的还有基因枪法、激光微束穿刺法、真空渗入遗传转化法和花粉介导法等。　　2.2.1电激法　　电激法最初是从哺乳动物细胞转化中发展起来的一门新技术，后来用于植物细胞的遗传转化。国外最早报道是1985年美国的Michael等将其用于植物转基因上。Chapel和Gimelius利用电激法将B一葡萄糖醛酸酶基因(gus)导入甘蓝型油菜的叶肉原生质体中，建立了瞬时表达系统。Guerche等(1987)利用此法将含卡那霉素抗性基因nptH导入甘蓝型油菜中。自此，电激穿孔法先后在烟草、玉米、水稻、马铃薯、番茄、大豆、小麦等作物原生质体上获得成功。　　2.2.2显微注射法　　显微注射法是使用专门的仪器将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中，而获得转基因再生植株的一种方法。显微注射法多年前在动物中就已获得成功，由此促进了它在植物细胞中的应用。Neuhaus等f1987)以甘蓝型油菜的花粉胚为受体，利用显微注射法将nptll基因的外源DNA注入细胞中。但这一方法需以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术。　　2.2.3基因枪法　　基因枪法是借用火药爆炸、高压气体或高压放电为动力，用微粒对植物进行轰击而将其上的外源基因带入到植物细胞内，此法可以不受基因型和轰击靶组织的限制(崔欣等，2001)。目前基因枪法在油菜的遗传转化中已有成功的报道。Fukuoka等(1998)利用基因枪法转化甘蓝型油菜小孢子并获得可育的转化植株。国内方面，侯丙凯利用此法将从苏云金芽孢杆菌中克隆得到野生型杀虫晶体蛋白基因导入油　菜叶绿体中获得4株转基因植株(侯丙凯和陈正华，20011。但基因枪方法的缺点是转化效率低，一般在0.1％-1％范围内，增加了选择的难度，且费用昂贵。　　2.2.4真空渗入遗传转化法　　真空渗入遗传转化法是一种简便、快速、且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转化方法。在油菜的遗传转化方面，目前国内已有成功的报道。张广辉等(1998)利用真空渗入法，以白菜型油菜子叶为受体进行转化，得到其转化株，转化率为2.11％。　　2.2.5激光微束穿刺法　　激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺，引起细胞膜的可逆性穿孔，从而导入外源DNA的一种基因直接转化技术。早在1987年，Weber等就利用微束激光将荧光素标记的外源DNA导入叶绿体中。这一技术操作简便，转化频率高，定位准确，对细胞损伤小以及外植体适用性广泛等优点。利用激光微束穿刺法导入植物的外源基因还有一些报告基因、筛选标记基因和抗病基因，侯丙凯首次报道利用激光微束穿刺法将杀虫蛋白基因导入油菜，并获得抗虫转基因植株的研究结果。　　2.2.6PEG法　　PEG融合法操作简单，处理量大，融合频率高，而且不影响再生，基本上已克服了再生植株是嵌合体情况的发生，而且不需要昂贵的仪器设备。其缺点是仍需进行原生质体培养、处理时问长、不易掌握、常形成多元原生质体融合体。有报道指出，将PEG法与电击法等其他导入基因的方法相结合，能够提高转化率。程振东等(1994)用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体并获得了再生转基因植株。　　2.2.7花粉介导法　　花粉介导法是山西省农科院生物中心的孙毅博士，王景雪博士等发明了一种新的植物转化方法，即利用生殖细胞――花粉作为载体，结合超声波处理介导外源基因对植物进行转化。花粉介导法避免了其它转化方法所要求的组织培养技术，转化方法简单、易操作、转化率高、且费用低，具有很强的实用性。利用花粉介导法，王景雪等(2001)获得了玉米转基因植株，随后解志红(2002)用这种方法在棉花上进行了试验，其转化频率为32％，杜春芳(2004)将GUS基因转入油菜中，其转化频率为2.8％。　　3油菜转基因研究中的问题与展望　　自1985年Ooms等利用农杆菌介导法获得第一株转基因油菜以来，转基因油菜的研制在近十多年来发展迅速，一系列抗病、虫、除草剂及高产优质的转基因油菜相继问世，抗虫和抗除草剂转基因品种已进入商业化生产。但是应该看到在油菜转基因领域中还存在许多有待解决的问题。　　3.1提高外源基因转化率并建立高频再生体系　　目前虽然已获得了许多转基因油菜植株，但大部分都是经过了大量的重复实验后仅得到的几个转化体克隆。一些转化受体如小孢子、叶绿体等的转化率一般在1％以下。另外一些转化方法如基因枪法、激光微束穿刺法、真空渗入法等，其转化率也很低，均达不到直接为生产服务的要求。因此，对现有的外源基因转化方法作一些改进或建立新的基因转化方法，提高转化率，建立高效的基因转化系统仍然是有待解决的问题。　　3．2提高对转基因油菜中外源基因的表达的调控及其遗传稳定性　　目前在油菜的遗传转化中，外源基因的插入整合基本上是随机的，其表达水平、表达的部位及时问也大多不受控制，因此对外源基因的表达调控基本上处于失控状态。另外，还有由于外源基因的随机插入及拷贝数高而引起转基因沉默现象。解决这些问题就需要深入研究植物的生长发育机理、采用特定的启动子、使用植物偏好密码子、研究及应用定点插入技术等方法。　　3.3与传统常规育种相结合　　利用基因工程方法获得的油菜转基因植株只是一种人工种质新材料，要使其成为生产上可以应用的新品种就必须经过常规育种程序的考验。转基因植株须经大田试验将外源基因持续遗传给后代，建立遗传稳定的品系，才可能最终取得经济效益和社会效益。而在现在的油菜转基因研究中，许多转基因植株未能保存，或不能通过种子将外源基因的性状遗传给子代，而且采用的大部分基因为报告基因，没有生产应用价值。　　3.4转基因油菜的安全性问题　　随着基因工程研究的进展，许多转基因农作物也进入了实用化、商品化阶段，而其安全性问题，也引起了广泛的争论，并且受到了各国政府的高度重视，转基因油菜也不例外地存在安全性问题。转基因油菜中的外源基因可来自植物、动物或微生物，一些基因虽已经过严格的安全性试验后才被允许进入商业化生产，但人们对转基因油菜仍然心存疑虑。但勿容质疑转基因油菜是油菜科学研究和生产的一场革命。现存的问题将是推动转基因油菜研究走向更加成熟、完善的动力，而不是阻力。